ネコ角膜壊死症の超微細構造学的特徴

OBJECTIVES:
(1) To describe the ultrastructural features of corneal sequestra in cats; and (2) to enhance our understanding regarding the pathogenesis of feline corneal sequestration.

METHODS:
Nine corneal sequestra were harvested via keratectomy from globes of nine cats. The sequestra were routinely fixed then postfixed for high resolution light and transmission electron microscopy (HR-LM and TEM, respectively). The tissues were embedded in Epon/Araldite. Sections of 0.5-microm thickness were cut and stained with 1% toluidine blue in 1% sodium tetraborate solution for HR-LM. Ultrathin sections were collected on copper grids and stained with uranyl acetate and Sato’s lead stain for TEM. Ultrathin sections were examined and the images were captured on an Advantage HR CCD camera using a Hitachi 7500 electron microscope operated at 80 kV. Two healthy corneas from two cats were harvested immediately following euthanasia. These corneal tissues (control samples) were processed in the same manner as the corneal sequestra for HR-LM and TEM. A portion of each sequestrum was also submitted for polymerase chain reaction (PCR) testing for infectious agents including feline herpesvirus-1 (FHV-1), Toxoplasma gondii, Chlamydophila felis and Mycoplasma spp.

RESULTS:
Ultrastructure of healthy corneal tissues revealed basal corneal epithelial cells aligned adjacent to a thin acellular layer similar to Bowman’s layer with underlying tightly packed, regularly arranged, collagen fibrils oriented in different planes. Keratocytes were elongated and had long and irregularly shaped nuclei, and cytoplasm contained rough endoplasmic reticulum and abundant membrane-bound vesicles. In contrast, corneal sequestra contained varying amounts of an amorphous, electron-dense substance, continuous with intact basal epithelial basement membranes peripherally, and overlying corneal ulceration and loosely packed collagen fibrils. Remnants of necrotic keratocytes were seen in spaces between disarranged collagen layers. In all samples, occasional keratocytes exhibited morphology indicative of apoptosis including clumping and margination of chromatin, and shrunken cytoplasm. Varying degrees of inflammation were noted on HR-LM and TEM of affected corneas including peri- and intralesional neutrophils, lymphocytes, plasma cells, and macrophages. Corneal sequestra were FHV-1-positive (n = 3), FHV-1- and T. gondii-positive (n = 1), T. gondii-positive (n = 3), or negative for DNA of these infectious agents (n = 2) using PCR. All corneal sequestra were negative for DNA of Chlamydophila felis and Mycoplasma spp. using PCR.

CONCLUSIONS:
Apoptosis may play a role in the pathogenesis of feline corneal sequestration independent of the presence of DNA of these infectious organisms. Prospective clinical studies are warranted to further understand the significance of T. gondii in relation to feline corneal sequestration.

目的:
(1)ネコの角膜壊死症の超微細構造特徴を記述し、(2)ネコ角膜分離症の病因についての理解を高めること。

方法:
9つの角膜壊死片を9匹のネコの眼球から角膜切除術を介して採取した。 壊死片は通常通り固定され、高分解能光および透過型電子顕微鏡(HR-LMおよびTEM)のために固定された。 組織はEpon/Alalditeに包埋された。 0.5μm厚のセクションに切片し、HR-LM用の1%テトラホウ酸ナトリウム溶液中で1%トルイジンブルーで染色した。 超薄切片を銅グリッド上で採取し、酢酸ウラニルおよびSatoのリード染色でTEM用に染色した。 超薄切片を調べ,80kVで操作された日立7500電子顕微鏡を用いてAdvantage HR CCDカメラ上で画像を得た。 安楽死後直ちに2匹のネコから健康な2角膜を採取した。 これらの角膜組織(対照試料)はHR-LMおよびTEMに対する角膜壊死片と同じ方法で処理した。 各壊死片の一部はまた、ネコヘルペスウイルス-1(FHV-1)、トキソプラズマ・ゴンディ、猫クラミジアおよびマイコプラズマ種を含む感染性物質のポリメラーゼ連鎖反応試験(PCR)のために提出された。

結果:
健康な角膜組織の超微細構造は、角膜基底上皮細胞を、ボーマン層と同様の薄い無細胞層に隣接して整列させ、異なる平面に配向した規則的に配置されたコラーゲン原線維を配向したものであった。 角膜実質細胞は伸長し、長くて不規則に形状の核を有し、細胞質は粗面小胞体および豊富な膜小胞を含んでいた。 対照的に、角膜壊死片は、様々な量の非晶質、電子密度の高い物質、正常の基底上皮基底膜と辺縁で連続し、角膜潰瘍および緩く充填されたコラーゲン原線維を含んでいた。 壊死した角膜実質細胞の残骸は、配列が乱れたコラーゲン層の間のスペースに見られた。 すべての試料において,時に角化細胞は,クロマチンの凝集とクロマチンの境界形成を示す形態を示し,細胞質の収縮を示した。 周辺および病変内好中球,リンパ球,形質細胞およびマクロファージを含む種々の程度の炎症が罹患した角膜のHR-LMおよびTEMで認められた。 PCRを用いたところ、角膜壊死片はFHV-1陽性(n = 3),FHV-1-およびT.gondii陽性(n = 1),T.gondii陽性(n = 3),またはこれらの感染因子(n = 2)のDNAがPCRで陰性であった。 PCRによると、すべての角膜壊死片は、猫クラミジアおよびマイコプラズマ属のDNAに対して陰性であった。

結論:
アポトーシスは,これらの感染性微生物のDNAの存在に依存しないネコ角膜隔離の病因として働いているかもしれない。 ネコの角膜壊死症に関連するT.gondiiの意義をさらに理解するためには、前向き臨床試験が必要である。